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问号钩端螺旋体LipL32-LipL41融合基因的克隆与原核表达被引量:1
2016年
目的构建钩端螺旋体融合基因lip L32-lip L41重组表达质粒,并获得重组表达的融合蛋白。方法设计引物,聚合酶链反应(PCR)从各参考标准株中扩增Lip L32、Lip L41基因,连接引物PCR法构建Lip L32-Lip L41融合基因,连接到大肠杆菌表达载体p ET28a上,构建p ET28a-Lip L32-Lip L41重组质粒,并转化到大肠杆菌DE3菌株中进行诱导表达,聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot鉴定融合蛋白的表达。结果扩增获得的Lip L32-Lip L41融合基因为1 900 bp,原核表达重组质粒p ET28a-Lip L32-Lip L41经酶切鉴定含有融合基因片段,在大肠杆菌中表达出Mr 90 000左右的重组融合蛋白Lip L32-Lip L41。结论成功构建钩体Lip L32-Lip L41融合基因,并在大肠杆菌中成果表达融合蛋白,为进一步评价Lip L32-Lip L41作为候选抗原诊断钩端螺旋体病的价值奠定基础。
胡玉山肖丽红刘巧谊周勇侯水平张欣强夏丹杨智聪
关键词:钩端螺旋体融合基因融合蛋白
lipL32-PCR应用于钩端螺旋体检测
2011年
目的探讨lipL32-PCR检测方法对钩端螺旋体(钩体)检测的可行性。方法根据外膜脂蛋白基因(lipL32)设计引物,与卫生行业标准推荐的引物G1/G2对比,进行特异性与灵敏度研究,并应用于常山县蛙、鼠肾脏标本钩体PCR检测;对浙江省2008年分离菌株进行钩体PCR鉴定。结果 lipL32-PCR具有较高的灵敏度和特异性,该引物可特异性扩增致病性钩体DNA,对本实验所用的其他细菌不扩增。2008年分离的钩体菌株PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符;鼠和蛙肾标本进行lipL32-PCR和卫生行业标准的G1/G2PCR检测,结果两法符合率为95.0%;lipL32-PCR检测阳性率为10.0%,G1/G2-PCR检测阳性率为5.0%,采用精确计算概率法进行阳性率比较,二者差异无统计学意义(P=0.25)。结论 lipL32-PCR检测方法可灵敏、特异地检测致病性钩体,能正确有效地反映野生动物带菌率,为控制钩体病提供依据。
姜理平陆群英罗芸叶菊莲张政徐宝祥
关键词:钩端螺旋体聚合酶链反应
重组外膜脂蛋白LipL32与致病性钩端螺旋体抗体的免疫反应性及与不同血清群交叉反应性的Western blotting评价
2011年
目的研究钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32与致病性钩体抗体的免疫反应性以及与不同钩体血清群之间的交叉反应性,为钩体病的血清学检测提供抗原。方法依据黄疸出血群赖型56601株外膜脂蛋白LipL32基因序列设计引物,扩增出该基因片段DNA,将其克隆至表达载体pET-28a中。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21并诱导表达,表达的重组蛋白纯化后采用Western blotting评价其与56601株及其他14个血清群致病性钩端螺旋体抗体的免疫反应性和交叉反应能力。结果扩增获得了56601株脂蛋白LipL32基因,成功构建了原核表达重组质粒pET28a-LipL32。重组蛋白rLipL32为包涵体表达,且与56601株及另外14个血清群的致病性钩端螺旋体的兔抗体发生了特异性免疫反应。结论原核表达重组外膜脂蛋白rLipL32在致病性钩体血清群之间有良好的交叉反应能力,可初步作为属范围内的钩端螺旋体抗体检测候选抗原。
段鸿元刘志国邱少富何斌赵海宋利华朱虹端青
钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体的制备及鉴定被引量:1
2010年
LipL32是钩端螺旋体外膜中含量最丰富的蛋白,有很好的免疫原性,且在致病性钩端螺旋体中高度保守。在非变性条件下纯化LipL32重组蛋白,与佐剂混匀后免疫BALB/c小鼠,取脾脏细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,然后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和有限稀释法分别进行筛选和细胞克隆,获得29株能稳定分泌抗LipL32单克隆抗体的杂交瘤细胞株,它们能识别8个LipL32抗原表位。用这些细胞株制备腹水型抗体,并对特性进行鉴定。用生物素标记这些抗体后两两配对,采用双抗夹心ELISA检测提取自15株致病性钩端螺旋体及其他致病菌的抗原,以评估单克隆抗体的灵敏度和特异度。筛选出1对灵敏度高和特异度好的单克隆抗体,ELISA检测rLipL32的最低浓度为1ng/ml。结果提示,该钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体及检测方法有很好的应用前景。
王亚琳张湘燕王压娣车小燕郭晓奎
关键词:钩端螺旋体LIPL32单克隆抗体酶联免疫吸附试验
Evolutionary Implication of Outer Membrane Lipoprotein-Encoding Genes ompL1,lipL32 and lipL41 of Pathogenic Leptospira Species被引量:1
2009年
Leptospirosis is recognized as the most widespread zoonosis with a global distribution. In this study, the antigenic variation in Leptospira interrogans and Leptospira borgpetersenii isolated from human urine and field rat kidney was preliminarily confirmed by microscopic agglutination test using monoclonal antibodies, and was further subjected to amplification and identification of outer membrane lipoproreins with structural gene variation. Sequence similarity analysis revealed that these protein sequences, namely OmpL1, LipL32 and LipL41, showed no more homologies to outer membrane lipoproteins of non-pathogenic Leptospira and other closely related Spirochetes, but showed a strong identity within L. interrogans, suggesting intra-specific phylogenetic lineages that might be originated from a common pathogenic leptospiral origin. Moreover, the ompL1 gene showed more antigenic variation than lipL32 and lipL41 due to less conservation in secondary structural evolution within closely related species. Phylogenetically, ompL1 and lipL4l of these strains gave a considerable proximity to L. weilii and L. santaro- sai. The ompI,1 gene of L. interrogans clustered distinctly from other pathogenic and non-pathogenic leptospiral species. The diversity of ompL genes has been an- alyzed and it envisaged that sequence-specific variations at antigenic determinant sites would result in slow evolutionary changes along with new serovar origination within closely related species. Thus, a crucial work on effective recombinant vaccine development and engineered antibodies will hopefully meet to solve the therapeutic challenges.
K. VedhagiriK. NatarajaseenivasanP. ChellapandiS.G. PrabhakaranJoseph SelvinS. SharmaP. Vijayachari
关键词:OMPL1LIPL32PHYLOGENY
犬钩端螺旋体黄疸出血群LipL32在大肠杆菌中的高效表达
2009年
本试验收集了临床发生黄疸病犬的尿液,提取基因组DNA,经16s rRNA基因PCR鉴定,表明该犬存在钩体黄疸出血群毒株感染。以该基因组DNA为模板,扩增获得lipL32基因,并对该基因进行了原核表达,结果显示该抗原在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。该蛋白的成功制备为犬钩体的诊断及新型亚单位疫苗的研制提供了广谱候选抗原。
宋翠萍贾雪波陈鸿军于圣青丁铲
关键词:钩端螺旋体
赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体的构建及在COS7细胞中融合表达的研究
2009年
从赖型钩端螺旋体017株全基因组中通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)分别扩增出脂蛋白32(LipL32)和溶血素-X(HlyX)基因,应用重叠延伸PCR技术(Gene splicing by overlap extension PCR,SOEPCR)获得LipL32-HlyX融合基因。以pcDNA3.1为载体,LipL32-HlyX为目的基因,双酶切构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经双酶切、PCR及测序鉴定证实重组质粒构建成功。脂质体转染法将构建成功的重组质粒转染COS7细胞,RT-PCR扩增出约2000bp的目的基因,Western blotting分析发现在75KD处出现特异性的阳性条带。结果证实赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体能在哺乳动物细胞中表达,为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础。
黄毕鲍朗钟琪张会东张英
关键词:钩端螺旋体真核表达
Calcium binds to LipL32, a lipoprotein from pathogenic leptospira, and modulates fibronectin binding
<正>Tubulointerstitial nephritis is a cardinal renal manifestation of leptospirosis. LipL32, a virulence factor...
Jung-Yu TungChien-Chih LinYi-Ching KoChih-Wei YangYuh-Ju Sun
文献传递
问号钩端螺旋体脂蛋白LipL32膜定位及其免疫应答
2008年
目的确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性脂蛋白抗原LipL32膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型。方法IPTG诱导目的重组蛋白rLipL32-1和rLipL32-2表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rLipL32。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区钩体患者血清标本及rLipL32兔抗血清与我国问号钩体参考标准株的交叉凝集情况。采用胶体金免疫电镜技术对LipL32进行膜定位。建立基于rLipL32的ELISA,检测钩体患者血清中特异性抗体类型及其水平。结果黄疸出血群是四川地区最主要的优势钩体血清群。rLipL32兔抗血清均能与我国问号钩体参考标准株发生MAT效价为1:80~1:320的交叉凝集反应。LipL32是位于钩体外膜表面的蛋白质分子。156例MAT阳性钩体患者血清标本中,rLipL32-1和rLipL32-2特异性IgM阳性率分别为91.0%~92.9%和90.4%~92.3%,特异性IgG阳性率分别为99.4%和97.4%~98.1%。结论LipL32是问号钩体属特异性表面蛋白抗原。自然感染钩体时,LipL32-1和LipL32-2可诱导机体产生IgM和IgG两类血清抗体。rLipL32-1和rLipL32-2可作为研制检测试剂盒的候选抗原。
罗冬娇郭宗琪胡野孙百莉潘建平严杰
关键词:问号钩端螺旋体抗原定位免疫应答
钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的克隆、表达及其在钩端螺旋体抗体检测中的应用
钩端螺旋体病/(简称钩体病/)是由致病性钩端螺旋体/(简称钩体/)引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病。钩体血清型别众多,临床表现多种多样。目前钩体病血清学的主要检测方法是国家标准即显微镜凝集试验/(MAT/),需要培养各...
徐国英
关键词:钩端螺旋体原核表达ELISA抗体检测
文献传递

相关作者

严杰
作品数:357被引量:1,059H指数:14
供职机构:杭州医学院
研究主题:问号钩端螺旋体 钩端螺旋体 幽门螺杆菌 原核表达系统 外膜蛋白
罗冬娇
作品数:58被引量:153H指数:7
供职机构:杭州师范大学
研究主题:问号钩端螺旋体 哮喘 钩端螺旋体 LIPL32 哮喘大鼠
范薇
作品数:46被引量:105H指数:5
供职机构:军事医学科学院实验动物中心
研究主题:实验动物 钩端螺旋体 LIPL32 外膜蛋白 ELISA检测
隋丽华
作品数:87被引量:283H指数:9
供职机构:军事医学科学院实验动物中心
研究主题:猕猴 实验动物 犬瘟热病毒 血液生理生化指标 血液生化
战大伟
作品数:86被引量:264H指数:9
供职机构:解放军总医院第一附属医院
研究主题:实验动物 比格犬 小鼠 血液生理 繁殖