王佳佳
- 作品数：15 被引量：38H指数：4
- 供职机构：浙江大学医学院更多>>
- 发文基金：浙江省教育厅科研计划中央高校基本科研业务费专项资金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学理学更多>>
- 分选方式对细胞能量代谢的影响研究
- 2024年
- Seahorse XF(extracellular flux)是从能量的角度检测代谢及调控的方法,因其实时检测的优点,具有非常好的应用前景,但该技术要求目的细胞纯度高、活性好,因此需要对原代细胞的分选条件进行优化。该文通过免疫磁珠分选技术和流式细胞分选技术对小鼠脾脏CD4+T细胞进行研究,结果发现两种分选方式纯化的CD4+T细胞在活性氧水平上无明显差异,相较于磁珠分选,流式分选纯化的CD4+T细胞线粒体膜电位、ATP合成相关的氧耗值和线粒体储备呼吸能力均呈现下降趋势,说明磁珠分选相较于流式分选对CD4+T细胞能量代谢的损伤更小。为了进一步了解流式分选的影响,该文对分选条件进行了研究。通过Moflo AstriosEQ分选仪中不加电分选模式(SD),加电分选模式不同偏振电压(700 V、2400 V、5000 V)以及同一偏振电压下不同液滴加电(35%、70%)对HEK 293T和Jurkat进行分选,结果发现SD组相较于加电分选模式对细胞代谢干扰较小,加电分选模式中5000 V实验组对细胞代谢有显著影响。同一偏振电压条件下,不同液滴加电实验组均未对细胞产生显著干扰。综上,磁珠法更适用于小鼠原代CD4+T细胞能量代谢实验前分选预处理。流式法用于能量代谢实验预处理时建议优先选择不加电分选模式,选择加电分选模式时建议使用小于2400 V的偏振电压。该实验结果为能量代谢检测实验提供了分选方式和分选条件的数据参考。
- 邢月婷李艳伟黄莹莹王佳佳郭春沈鑫周南沈红英宋兴辉
- 关键词：磁珠分选活性氧线粒体膜电位能量代谢
- 一种新的皮肌炎患者外周血Treg淋巴细胞亚群的多色分析方法的建立
- 2022年
- 为探索建立新的皮肌炎患者外周血Treg淋巴细胞亚群分析方法,利用流式细胞仪设计并优化针对Treg细胞的15色流式染色方案。该文收集了皮肌炎患者和健康志愿者的外周血,用密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。该研究分别对抗体浓度、染色时间、孵育温度、是否避光、荧光素放置时间及上机收样电压等进行优化,最终完成单样品15色高通量流式检测,并结合FlowJo软件对目标细胞Treg亚群进行高阶数据分析。结果表明,(1)BLANK十字架法结合染色指数法可确立方案(Panel)的最适电压值;(2)抗体TIGIT BV421、HLA-DR PE、CD127 BV605、CD103 R718、CD25 PE-Cy7滴定后的最优标记量分别为1.25、1.25、3、2.5、5μL/test(100μL染色体积/test);(3)多色流式抗体染色的最佳条件是4°C、避光条件下孵育30 min;(4)样本制备后应尽快检测,放置时间不超过24 h。该研究中建立的15色Panel可成功分析人PBMC样本Treg细胞亚群及相关活化分子的表达情况。此方法可应用于以皮肌炎为代表的伴有Treg细胞缺陷的外周血Treg淋巴细胞亚群的分析。
- 黄莹莹姜宇邢月婷李艳伟郭春王佳佳徐琴
- 关键词：皮肌炎
- 一种细胞外囊泡的流式检测方案的探索与建立被引量：1
- 2021年
- 该研究旨在探索细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)分析的标准化流程,建立一种高效的EVs检测方法,为EVs功能及临床转化研究提供技术支撑。实验采用经典的超速离心法分离EVs,借助已知直径的聚苯乙烯微球设定并优化流式检测EVs的参数,联合应用散色光信号及荧光信号对EVs进行双参数分析鉴定,最后通过电镜观察及蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)对鉴定结果进行验证。结果显示,参照纳米微球设定的条件可清楚地将100 nm颗粒信号与噪音信号分离,且微球稀释的梯度和检测到的浓度之间呈线性相关,可以对EVs进行定量分析;荧光染色结果显示,EVs呈CFSE(5,6-Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,蛋白结合染料)及FM1-43(fixable analog of FM?1-43 membrane stain,亲脂性染料)双阳性,占比约3%;电镜验证其形态及直径与预期相一致。该研究通过优化流式方案及双荧光参数分析鉴定探索了EVs流式检测的标准化流程,建立了高效、准确的EVs流式检测方法。
- 郭春王佳佳李艳伟邢月婷宋兴辉黄莹莹叶小康
- 关键词：流式细胞术
- 基于实时无标记技术研究流式分选后细胞活性的检测方法
- 2022年
- 利用流式细胞法、细胞计数试剂盒(CCK-8)法、实时细胞功能分析(RTCA)法分别检测分选前后细胞的活性,综合比较了3种方法的检测原理、操作特点等。结果显示,流式细胞法测得的分选后细胞凋亡率为(3.85±0.008)%,分选前细胞凋亡率为(14.09±0.021)%,分选后细胞凋亡率低于分选前,具有统计学差异(P<0.05);分选前后的活细胞比例显示,分选后活细胞比例高于分选前,具有显著性统计学差异(P<0.001)。CCK-8法测得的分选后细胞活性高于分选前,具有显著性统计学差异(P<0.001);RTCA法测得的分选后细胞连续增殖活性明显高于分选前,具有极显著性统计学差异(P<0.0001)。结果显示,相较于CCK-8法和流式细胞法,RTCA法的细胞用量少、可回收,操作简便,无需标记,检测灵敏度高,可获得实时动态的细胞生长曲线,适合研究分选后细胞长效动态的活性变化,可为基础和临床分选后活细胞的功能研究提供检测手段。
- 李艳伟王佳佳邢月婷郭春黄莹莹宋兴辉黄琼
- 关键词：流式细胞分析CCK-8细胞活性
- 不同激发方式的流式细胞分选仪一体化管理模式研究被引量：3
- 2022年
- 目的:研究建立不同激发方式的流式细胞分选仪一体化管理模式,探讨其应用效果。方法:针对流式分选仪的组成、工作原理、环境要求、人员要求、培训交流、操作管理及注意事项,探讨激光在空气中激发和在石英杯中激发两种流式细胞分选仪的使用及管理方法。结果:总结出一套日常维护、运行及培训的开放一体化管理模式,仪器每日稳定运行较一体化管理之前的8 h提高到10~12 h,运行机时数>1500 h/年,分选后细胞活性>90%,分选细胞纯度>99%,污染率<1%,样品堵塞<2%。结论:不同激发方式的流式细胞分选仪一体化管理模式能够加强仪器运行及维护管理,可使仪器使用者快速熟悉操作分选仪,延长分选仪使用寿命,提高分选仪使用率,为获得高纯度、高活性和高得率细胞提供保证,为科学研究、实验教学及技术开发提供更优质服务。
- 李艳伟王佳佳黄莹莹宋兴辉
- 实时无标记肿瘤细胞凋亡筛选技术体系的建立被引量：3
- 2019年
- 将xCELLigence-RTCA细胞分析系统的实时无标记技术和流式细胞术结合,建立实时无标记的肿瘤细胞凋亡筛选技术体系。利用顺铂诱导非小肺癌细胞A549凋亡,使用xCELLigence-RTCA系统连续监测96 h获取A549细胞动态生长曲线图谱,分析图谱确定细胞凋亡最佳检测时间点和半有效抑制浓度(IC50),联合流式细胞术的精准定量技术,分析顺铂作用后A549细胞的凋亡率。结果确定这种实时无标记细胞凋亡筛选技术体系用于肿瘤细胞凋亡筛选的可行性和可靠性。
- 李艳伟宋兴辉王佳佳刘丽黄莹莹郭春
- 关键词：凋亡检测流式细胞术
- 活细胞标记和流式细胞术应用于体外检测巨噬细胞吞噬活性的方法建立被引量：3
- 2020年
- 目的:通过活细胞标记和流式细胞术的联合应用,建立一种方法研究体外巨噬细胞的吞噬活性。方法:研究采用活细胞示踪染料CFSE标记对照组巨噬细胞,对未标记CFSE的细胞使用免疫刺激剂LPS处理,两组细胞混匀后与预先超声处理过的Alexa594标记的大肠杆菌孵育,在一个体系中完成吞噬过程,流式细胞术检测双荧光信号来评价对照组细胞和LPS处理后细胞的吞噬活性。结果:对照组和LPS处理组巨噬细胞的吞噬率分别为48.6%和62.3%,LPS处理后巨噬细胞的吞噬活性明显升高,与文献报道一致。实验表明,通过活细胞标记区分,在同一体系中完成LPS处理和未处理细胞的吞噬活性检测是非常可行的。也正因为待比较吞噬活性的两组细胞处在同一个吞噬环境中,吞噬率反映的吞噬活性更为准确。结论:本研究应用活细胞标记和流式细胞术,成功建立了一种实现体外处理的巨噬细胞吞噬活性的检测方法,简便、准确、可信度高。
- 王佳佳王磊王磊宋兴辉李艳伟黄莹莹黄莹莹
- 关键词：巨噬细胞流式细胞术
- 高校大型仪器共享平台人才培养模式路径探析——基于浙江大学医学院公共技术平台的实践与探索被引量：13
- 2022年
- 高校大型仪器平台已成为推进高校科研能力提升的重要技术条件保障。随着高校科研能力和技术的发展,高校大型仪器共享平台经历了由仪器操作服务向仪器开发创新、人才培养的转变。基于此,该文以加强实验技术创新为主线,搭建了三维教学模式,着力将平台打造成高层次技术人才培养、高水平仪器技术孵化的教学科研基地,为新时代高校科研发展提供技术支撑。
- 宋兴辉刘双双黄莹莹李艳伟王佳佳郭春邢月婷
- 关键词：大型仪器共享平台
- 外泌体不同制备方法的综合实验教学实践
- 2024年
- 流式细胞术随着单克隆抗体技术和光电技术的快速发展而日趋多元化和多样化。然而,该技术仍受流式细胞仪检测极限的限制而制约外泌体等细胞外囊泡的分离纯化。该文通过对外泌体样本制备方法的建立和探索,使流式细胞技术理论与实验教学内容更加直观、更易理解和掌握。该方法包括对流式细胞仪配置及实验参数的优化、外泌体的不同制备方法(超速离心、流式细胞分选)、纳米流式分析鉴定、电镜成像鉴定等步骤。通过对该方法的实践操作,使学生充分掌握相关的检测技术和数据分析手段,为流式细胞术在外泌体分选及后续功能研究中提供支撑作用。教学、科研、实践相融合,极大地激发了学生学习实验技能的兴趣和积极性,大大提升了学生实验技能水平以及科研创新能力等科研素养,为新时期全能型科研创新人才的培养提供助力。
- 李艳伟郭春周南黄琼王佳佳陈静瑶黄莹莹沈鑫于晓敏沈红英
- 关键词：外泌体流式细胞术超速离心综合实验教学
- “小鼠脾脏单细胞悬液不同制备方法及其流式细胞术检测”综合实验的建立与探索被引量：4
- 2023年
- 由于流式细胞术应用中涉及的样品制备、仪器使用和数据解读均比较复杂,该文对流式实验教学的内容和形式进行了有益的探索,建立了“小鼠脾脏单细胞悬液不同制备方法及其流式细胞术检测”的综合性实验。新方法不仅包含小鼠原代组织取材、单细胞悬液不同制备方法(手动解离、自动解离)、流式细胞仪计数、显微观察等步骤,而且能涵盖流式抗体的配色与标记、流式细胞仪操作、数据分析(T淋巴细胞亚群的分群)等多个知识点,并围绕不同解离方法对实验结果的影响进行了探讨,极大地改善了实验教学效果和质量,充分发挥了流式细胞术在高校教学和科研中的重要支撑作用,使学生学会完整的流式技术链条,并提升了其科研能力与创造力,从而为培养复合型科研人才提供助力。
- 黄莹莹邢月婷阿依西布·萨吾提杨丹李艳伟王佳佳郭春周南
- 关键词：单细胞悬液实验教学
