方和俊
- 作品数：11 被引量：15H指数：2
- 供职机构：四川农业大学动物医学院更多>>
- 发文基金：四川省科技支撑计划长江学者和创新团队发展计划国际科技合作与交流专项项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 猪腺病毒3型PCR检测方法的建立及Hexon基因克隆分析
- 猪腺病毒3型(Porcine adenovirus3，PADV-3)是猪腺病毒中最常见的一种血清型，主要引起猪群腹泻。1964年Haig首次从英格兰腹泻仔猪直肠拭子中分离到该病毒，随后在澳大利亚、美国、加拿大、西班牙、中...
- 方和俊
- 关键词：聚合酶链式反应基因克隆
- PEDV、TGEV、RV和PToV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用
- 引言自2011年以来猪腹泻病广泛流行于我国各地,患病仔猪发病率、死亡率均可高达80%以上,给养猪业造成了严重经济损失。猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE),猪流行性腹泻(P...
- 刘小琬周远成杨凡方和俊郭博蔡雨函徐志文
- 文献传递
- 猪伪狂犬病毒Fa株侵染对PK-15细胞microRNAs表达谱的影响
- 2016年
- 【目的】分析猪伪狂犬病毒Fa株(PRV-Fa)侵染对猪肾传代细胞PK-15 microRNAs(miRNAs)表达谱的影响。【方法】利用Illumina高通量测序技术,鉴定感染和非感染PRV-Fa的PK-15细胞的miRNAs;筛选并利用实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)验证差异表达miRNAs;对差异miRNAs进行靶基因预测和Gene ontology(GO)分析。【结果】在感染和未感染PK-15细胞中分别检测到384个和405个miRNAs,其中感染PRV-Fa后差异表达的miRNAs共127个(60个上调,67个下调)。荧光定量结果显示差异miRNAs的表达趋势与高通量测序结果一致。GO分析显示,miRNAs广泛参与信号传导、细胞代谢、免疫反应、基因表达等生物学进程,其中miR-10b、miR-16、miR-18a、miR-19b、miR-20a、miR-145-5p、miR-146a、miR-181a、miR-499-5p等miRNAs与免疫相关。在靶基因调控网络图中,ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d处于关键位置。研究鉴定出5个新的病毒编码miRNAs,其中PRV-miR-LLT2与PRV-miR-LLT4靶向PRV早期蛋白基因EPO。【结论】伪狂犬病毒Fa株感染对PK-15细胞编码miRNAs有显著影响。
- 刘鹏娟乔小改李萍黄剑波卓秀萍方和俊邓益超徐志文朱玲
- 关键词：猪伪狂犬病毒MICRORNASPK-15细胞
- 一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施被引量：1
- 2015年
- 无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织,进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离,将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度,并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果:PRV阳性病料接种PK-15细胞,传至第5代后产生稳定细胞病变,主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑,而对照组细胞贴壁生长良好;基于PRV gE基因的PCR检测,扩增产物为378 bp,与预期目的条带一致;用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×104 PFU/mL;琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性,据此为猪场提出综合防治措施。
- 杨凡徐志文李萍方和俊郭博周远成
- 关键词：猪伪狂犬病病毒
- 一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施被引量：2
- 2016年
- 无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织，进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离，将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度，并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果：PRV阳性病料接种PK-15细胞，传至第5代后产生稳定细胞病变，主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑，而对照组细胞贴壁生长良好；基于PRVgE基因的PCR检测，扩增产物为378bp，与预期目的条带一致；用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×104PFU／mL；琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性，据此为猪场提出综合防治措施。
- 杨凡徐志文李萍方和俊郭博周远成
- 关键词：猪伪狂犬病病毒
- 猪环曲病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用被引量：1
- 2015年
- 为建立快速检测猪环曲病毒(PToV)的RT-LAMP方法,根据GenBank中发表的N蛋白基因序列,设计合成4条特异性LAMP引物,通过敏感性试验和特异性试验,建立了PToV RT-LAMP检测方法,并对71份临床粪便进行了检测应用。结果显示,本试验建立的PToV RT-LAMP检测方法在65℃60min条件下可扩增出特异性梯状DNA条带,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪环曲病毒的核酸无交叉反应;检测极限为10copies/μL,比普通RT-PCR的灵敏度高10倍,表明该检测方法具有较强的特异性及灵敏性。用建立的RT-LAMP方法进行的样品检测结果显示,受检的71份样品中有17份检测结果为阳性,该结果与常规RTPCR检测结果吻合,总的阳性率为23.9%。
- 刘小琬蔡雨函周远成杨凡刘鹏娟黄剑波方和俊朱玲徐志文
- 关键词：RT-LAMP
- PADV3自然感染猪组织中病毒含量的实时荧光定量PCR检测被引量：1
- 2017年
- 为了解猪腺病毒3型(PADV3)在自然感染猪体内不同器官组织中的分布情况,利用实时荧光定量PCR检测方法,定量检测了自然感染PADV3的仔猪、妊娠母猪以及与猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的仔猪不同器官组织中PADV3病毒的含量。结果,在感染的猪体多种器官组织中均可检测到PADV3,但是在各器官组织中病毒的含量有差异,其中肠黏膜、肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体中病毒含量较高,心、肝、脾组织中病毒含量较低;在同时混合感染PCV2的仔猪肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体中PADV3含量显著增加。结果表明,PADV3对猪肠黏膜、肺组织、肠系膜淋巴结、扁桃体有较强的嗜性,对心、肝、脾组织的嗜性相对较弱;PCV2混合感染可促进PADV3在仔猪体内的增殖,能增强PADV3对感染器官组织的亲嗜能力。
- 吕雯婷方和俊赵军李萍许思遥杨凡徐志文朱玲
- 关键词：猪圆环病毒2型
- 猪萨佩罗病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用被引量：7
- 2015年
- 为建立猪萨佩罗病毒（PSV）的检测方法,根据GenBank中PSV的5′端非编码区基因的保守序列设计并合成1对针对PSV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PSV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PSV与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪嵴病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒区分开,特异性强。检测下限为6.37×10^2 copies/μL,比普通PCR敏感100倍,敏感性高。扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RTPCR的批内变异系数为0.44%～1.14%,批间变异系数为0.70%～1.32%,重复性较好。应用该方法对采集自四川省部分地区的58份有腹泻症状的猪粪便进行检测,实时荧光定量RT-PCR检测阳性率为56.9%,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的实时荧光定量RT-PCR特异性较强、灵敏度高,可用于该病毒的临床检测、定量分析及流行病学调查。
- 郭博方和俊刘小琬杨凡刘鹏娟黄剑波李萍徐志文朱玲
- 关键词：SYBR实时荧光定量RT-PCR
- 猪腺病毒3型SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用被引量：1
- 2015年
- 为建立一种针对猪腺病毒3型（PADV3）的检测方法,根据PADV3E1B基因保守序列设计1对引物,建立了检测PADV3的SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR。结果显示,该方法不能对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌、猪链球菌2型检测到荧光信号,特异性好;检测PADV3时在3.7×10^2-3.7×10^9 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,熔解温度为90.5℃;该方法组内变异系数为0.17%-1.23%,组间变异系数为0.73%-2.23%,重复性较好。应用该方法对临床56份腹泻粪便检测,检出11份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。上述结果表明,建立的实时荧光定量PCR为PADV3感染的早期诊断、流行病学调查奠定了技术基础。
- 方和俊郭博黄剑波刘小琬刘鹏娟李萍杨凡朱玲徐志文
- 关键词：SYBR实时荧光定量PCR
- 猪腺病毒血清3型PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查被引量：3
- 2015年
- 为建立一种猪腺病毒3型（PADV-3）的检测方法，本研究根据PADV-3E1B基因保守序列设计一对引物，建立了PcR检测方法。特异性试验结果显示，该方法仅对PADV．3扩增出247bp的目的片段。而对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、大肠杆菌、猪链球菌均无特异性扩增；敏感性试验结果显示，该方法对PADV-3最低检测量为3．7×10-5拷贝／μL。应用该方法对我国四川省23个规模化猪场进行流行病学调查，结果显示PADV．3阳性率达到14．72％，在腹泻猪群中阳性率为17．34％，并且显著高于非腹泻猪群（6．41％），PADV．3在保育猪群中感染率最高（26．32％），表明PADV．3在我国四川省猪群中广泛流行。本研究建立的PCR检测方法特异性强、灵敏度高，可以应用于猪群中PADV．3的流行性调查。
- 方和俊刘鹏娟郭博刘小琬李萍杨凡黄建波朱玲徐志文
- 关键词：PCR检测流行病学调查
