吴一凡
- 作品数：7 被引量：91H指数：3
- 供职机构：南京师范大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：南京师范大学校科研和教改项目教育部基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 一种新细胞因子基因真核表达载体的构建和鉴定
- 2001年
- 采用PCR方法 ,以人胎盘cDNA文库为模板 ,扩增出人B淋巴细胞刺激因子 (hBLyS) ,经克隆测序及纯化后 ,再以此PCR产物为模板 ,用Nest PCR方法进一步扩增得到人B淋巴细胞刺激因子的胞膜外功能区域(hsBLyS)的DNA片段 ,纯化、克隆测序鉴定后 .扩增并纯化质粒 ,经酶切、纯化后克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中 ,构建成真核表达载体pcDNA3.1(+) /hsBLyS .结果表明 :用此方法制备得到的hsBLyS的DNA片段经测序鉴定与文献报道相符 ,构建的真核表达载体经鉴定也达到了预计的结果 .
- 刘平张双全李东霞闫晓梅吴一凡
- 关键词：PCR人胎盘CDNA文库基因载体
- 重组人TRAIL胞外片段的原核表达系统选择及蛋白复性研究
- 2006年
- 采用PCR技术从人肝脏cDNA文库扩增出编码114～281位氨基酸的TRAIL基因片段,将之克隆至原核表达载体pET-30a、pQE-30和pJLA503中,上述重组载体经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE鉴定显示pET-30a系统表达效率最高,目的蛋白占菌体总蛋白含量的40%左右;采用透析法或梯度稀释法对TRAIL胞外区片段包涵体进行复性,非还原SDS-PAGE的结果显示梯度稀释法明显好于透析法;纯化后的TRAIL胞外区片段蛋白具有明显的生物学活性,效果与标准品相似;通过添加不同的折叠促进剂对复性效率影响的研究,确立了TRAIL胞外区片段适宜的复性方法,复性效率达75%～80%.
- 吴冬梅金丽娜刘顺谊司马健邰一琳吴一凡乔波殷志敏
- 关键词：TRAIL蛋白表达复性细胞凋亡
- 耐热嗜酸古细菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆、诱导表达和活性测定被引量：4
- 2002年
- 采用DEAE Sepharose及SephacrylS 30 0柱分离纯化了耐热嗜酸古细菌Sulfolobusacidocaldarius谷氨酰胺合成酶 (E 6 .3.1.2 ,Sac GS) .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子质量为 5 3ku的单一条带 .测定其N端氨基酸序列为PGLPKNEHEALEFLKSNNIKWVDLQ ,与其他古细菌谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列进行比较后 ,发现均存在ATP结合保守序列TFMPKP (I/L/F) (F/P/Y) (G/R) .采用碱基的简并性设计出一对简并引物 ,以Sulfolobusacidocaldarius的基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,获得 780bp的DNA片段 ,经克隆测序后确定为谷氨酰胺合成酶基因片段 ,以地高辛标记的该片段为探针 ,将Sulfolobusacidocaldarius基因组DNA用不同的限制性内切酶分别进行单双酶组合切割 ,然后进行DNA印迹分析 ,选出了 2 4kb的BamHⅠ /HindⅢ双酶切片段 ,并克隆到pBluescriptKS+ 质粒中 ,通过菌落原位杂交获得阳性克隆 ,进行DNA全序列测定后 ,得到完整的1 5kb的谷氨酰胺合成酶全基因序列 ,再将其克隆到 pET3c载体中 ,在大肠杆菌BL2 1中进行诱导表达并进行相应的活性测定 ,其酶活力的最适温度为 90℃ .
- 殷志敏闫淑珍戴谷吴一凡张双全
- 关键词：谷氨酰胺合成酶基因基因克隆活性测定
- 人B淋巴细胞刺激因子的可溶性功能区（hsBLys）的克隆、表达及分离纯化
- 2003年
- 在已有的pET30a/hs表达载体的基础上，构建了原核表达载体pET30a/hsBLYS(His6)、经双酶切分析和DNA测序后，转化入表达宿主大肠杆菌M15，IPTG诱导后得到高效表达(目的蛋白约占总菌蛋白的35％)；表达产物大部分以包含体形式存在。采用本室自行研制的Ni^2+亲和层析胶(Ni^2+—IDA)纯化可溶部分的重组融合蛋白，经SDS—PAGE鉴定为单一条带。
- 刘俊红吴一凡张双全
- 关键词：HSBLYS分离纯化克隆免疫学细胞因子
- 乳糖诱导pET载体表达重组蛋白的研究被引量：78
- 2002年
- 以重组人B淋巴细胞刺激因子 (hBLyS)蛋白表达宿主菌株BL2 1(DE3) (pET30 (a) /hBLyS)作为研究对象 ,借助SDS PAGE分析方法 ,对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了优化研究 .分析比较了诱导的起始阶段、所需的乳糖浓度和诱导持续时间等参数对重组产物表达的影响 .实验结果表明 ,对于T7lac启动子控制的重组目的产物 ,乳糖可以作为诱导剂 ;在对诱导条件进行优化控制的前提下 ,乳糖诱导目的产物的绝对表达量虽然不及IPTG ,但相对成本却比IPTG低得多 ,且没有毒性 .研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组基因工程药物工业化生产提供了一定的参考 .
- 吴一凡张双全高秀玉刘晓宇
- 关键词：重组蛋白乳糖SDS-PAGE诱导剂
- B淋巴细胞刺激因子(BLyS)研究进展被引量：8
- 2001年
- B淋巴细胞刺激因子 (BLyS)是 1999年新发现的一种重要的细胞因子 ,属于肿瘤坏死因子 (TNF)超家族成员 .在体液免疫调控中起重要作用 .它能强烈地刺激B淋巴细胞的增殖和分化并分泌大量免疫球蛋白 (主要为IgM) ;在体外其过量表达能促进多种B系肿瘤细胞的生长 .BLyS转基因小鼠出现严重的红斑狼疮样症状 .对BLyS的基因和蛋白质结构、免疫调控功能。
- 吴一凡张双全
- 关键词：细胞增殖体液免疫受体自身免疫性疾病
- 耐热嗜酸古细菌Sulfolobus acidocaldarius谷氨酰胺合成酶的表达调控和性质研究被引量：2
- 2003年
- 古细菌Sulfolobusacidocaldarius细胞内谷氨酰胺合成酶的表达量随着培养条件的改变有较大差异,RNA印迹表明,该差异是在mRNA水平受到调控.经DEAE Sepharose和SephacrylS 30 0两步分离酶蛋白,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和凝胶过滤测定分子质量,表明该酶为 12个相同亚基组成,分子质量为 6 30ku的多聚体.该酶的最佳pH为 7 3;对羟胺、谷氨酰胺、ADP和Mn2 + 的Km 值分别为 3 5mmol/L、1 3mmol/L、0 15mmol/L和 0 2 4mmol/L;其γ 谷氨酰转移酶活性和生物合成酶活性的最佳温度均为 90℃.Arrhenius曲线表明,γ 谷氨酰转移酶的活化能为4 7kJ/(mol·K),生物合成酶的活化能分别为2 9kJ/(mol·K)(4 0～ 75℃)和 10kJ/(mol·K)(5 5～ 90℃).对该酶的抑制剂研究发现,与其他来源的谷氨酰胺合成酶不同,甘氨酸、L 丙氨酸能明显抑制S.acidocaldarius谷氨酰胺合成酶的活性,而常规的抑制剂如L 色氨酸、L 组氨酸、5′ AMP却没有抑制作用,甘氨酸、L 丙氨酸的抑制作用为竞争性抑制。
- 殷志敏陈群英司马健吴一凡张双全
- 关键词：谷氨酰胺合成酶纯化热稳定性抑制剂
