范小波
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 供职机构：东南大学医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选被引量：4
- 2007年
- 目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取8个克隆,提取DNA后测序;测序阳性的DNA转化E.coliHB2151,IPTG诱导后用间接ELISA方法检测培养上清单链抗体的活性。MTT法测定单链抗体对CTGF促人近曲肾小管上皮HK-2细胞增殖作用的影响。结果:从8个克隆中获得7个完全一致的DNA序列(W0616);另有1个克隆丢失了重链,且轻链框架区(FR)和互补决定区(CDR)序列与W0616不一致;阳性克隆经诱导后,培养上清用间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.001)。同时,该单链抗体片段能明显抑制CTGF引起的HK-2细胞的增殖。结论:成功获得与CTGF特异结合的人源单链抗体可变区序列,为CTGF抑制剂的研究奠定基础。
- 吴国球刘乃丰赵桂琴范小波张臣王明虹
- 关键词：结缔组织生长因子噬菌体展示
- 一种新型结缔组织生长因子人源单链抗体的可溶性表达以及分离纯化
- 2010年
- 目的:研究单链抗体(scFv)在不同载体和菌株中的表达以及表达产物的免疫学活性评价。方法:将人源化单链抗体的基因通过酶切、连接等生物技术的方法克隆到pET28a、pET32a和pET-EI:X3种不同的载体中,并选用不同的表达菌株进行表达,观察单链抗体的表达情况并对抗体的可溶性表达进行优化,采用亲和层析和分子筛层析对目的蛋白进行纯化,并在体外研究目的蛋白的生物学活性。结果:抗结缔组织生长因子单链抗体在pET28a/BL21(DE3)中不能表达,在pET32a/BL21(DE3)和pET-EI:X/BLR(DE3)中均成功表达,但是在pET-EI:X/BLR(DE3)中scFv抗体无法从内含肽(intein)上裂解。scFv在pET32a/BL21(DE3)中表达量占总蛋白的30%左右,经过两步层析纯化后纯度达到85%以上。体外免疫试验显示,目的蛋白具有良好的免疫学活性。结论:人源化抗结缔组织生长因子单链抗体scFv在大肠杆菌中的表达需要分子伴侣,通过低温表达策略在pET32a/BL21(DE3)中成功得到表达。
- 范小波苟丽霞刘昭沈子龙刘乃丰吴国球奚涛
- 关键词：人源单链抗体结缔组织生长因子弹性蛋白分离纯化
- 结缔组织生长因子CT结构域的原核表达及分离纯化
- 2017年
- 目的:构建pET32a-TrxA-His-CTGF-CT原核表达载体,实现重组CTGF-CT的可溶性表达及分离纯化,以用于制备CTGF-CT抗体。方法:基因合成CTGF-CT序列,利用NcoI和XhoI限制性内切酶双酶切后插入pET32a载体,构建pET32a-TrxA-His-CTGF-CT重组质粒,阳性质粒转化E.coli strain BL21(DE3)细胞,通过异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组融合蛋白,利用镍柱亲和纯化及肠激酶酶切纯化获得目的蛋白CTGF-CT,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度并进行Western blotting分析。结果:所构建pET32a-TrxA-His-CTGF-CT重组质粒验证正确。经诱导表达获得了与预期分子量(28 kD)一致的融合蛋白,融合蛋白经肠激酶切割及两次镍柱亲和纯化获得目的蛋白CTGF-CT,纯化后纯度约95%,Western blotting分析表明纯化目的蛋白为CTGF-CT。结论:通过构建原核pET32a-TrxA-His-CTGF-CT表达载体实现了重组CTGF-CT蛋白的表达及分离纯化,为CTGF-CT抗体的制备和CTGF-CT功能的深入研究打下了基础。
- 薛秀蕾范小波吴国球
- 关键词：结缔组织生长因子原核表达蛋白纯化
