毛侃琅
- 作品数：30 被引量：21H指数：4
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- 促进3β-HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用
- 本发明公开了一种促进3β‑HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用。该表达载体包括慢病毒载体pLVX‑mCMV‑ZsGreen‑PGK‑Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段。...
- 徐新云王利毛侃琅彭鹏
- 文献传递
- CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定
- 2014年
- 目的:应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法:根据GenBank提供的CYP2E1基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果:测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论:成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制研究。
- 徐新云毛侃琅周丽吴德生毛吉炎谢杏秦逍云谭琴
- 关键词：CYP2E1基因慢病毒载体过表达
- 细胞色素氧化酶2E1基因沉默对三氯乙烯致L02肝细胞毒性的影响被引量：5
- 2013年
- 目的通过RNA干扰技术，构建细胞色素氧化酶（CYP）2E1基因慢病毒表达载体，研究CYP2E1基因沉默对三氯乙烯（TCE）致肝细胞毒性的影响。方法设计合成shRNA片段连接到慢病毒载体，筛选单菌落，经聚合酶链式反应（PCR）和测序鉴定后提取质粒，转导L02肝细胞中，筛选CYP2E1缺陷型细胞，利用荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法（Westernblot）鉴定干扰效果。以不同浓度（0、0．25、0．50、1．00、2．00、4．00mmol/L）TCE分别对L02肝细胞和CYP2E1基因沉默细胞染毒，测定TCE对2种细胞的存活率及IC50，应用流式细胞仪测定细胞凋亡率，采用实时荧光定量PCR检测细胞凋亡基因和癌基因mRNA表达水平。结果正常L02肝细胞对TCE的IC50为15．1mmol／L，CYP2E1沉默细胞对TCE的IC50为23．6mmol／L。随TCE剂量增加两组细胞凋亡率升高，2．0、4．0mmol／LTCE染毒剂量时，CYP2E1沉默细胞的凋亡率明显低于L02肝细胞组，差异有统计学意义（P〈O．05或P〈0．01）。TCE染毒后CYP2E1沉默细胞的抗凋亡基因Bcl-2表达水平比L02肝细胞升高15％-60％，凋亡基因caspase-3和caspase-9表达水平比L02肝细胞下降30％-60％，差异均有统计学意义（尸〈O．01）。抑癌基因p53表达水平明显高于L02肝细胞，升高81％-278％；癌基因c．fos和k-ras明显低于L02肝细胞组，下降20％～68％，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论利用慢病毒介导RNA干扰技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。沉默CYP2E1基因可降低TCE对肝细胞毒性，抑制部分凋亡基因与癌基因表达，提示CYP2E1基因在三氯乙烯代谢过程中发挥重要作用，与三氯乙烯毒性存在一定关系。
- 徐新云毛吉炎毛侃琅刘国红慈捷元杨细飞吴德生黄海燕张然黄新凤
- 关键词：三氯乙烯慢病毒载体基因沉默
- CYP3A4高表达肝细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响
- 2013年
- 目的建立CYP3A4高表达肝细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响。方法 PCR扩增CYP3A4基因并将其克隆到慢病毒高表达载体中,将已经构建的慢病毒载体进行转染后,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌罗霉素进行筛选得到CYP3A4高表达肝细胞株,通过荧光定量PCR和Western蛋白质印迹法鉴定细胞株。用三氯乙烯0,0.25,0.5,1.0,2.0和4.0mmol·L-1对正常肝肝细胞和CYP3A4高表达肝细胞进行染毒12h,实时定量PCR检测凋亡基因bcl-2,胱天蛋白酶3,胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9以及癌基因c-fos,c-myc,K-ras和p53的表达。结果测序证明重组慢病毒高表达载体CYP3A4基因序列正确,荧光定量PCR检测CYP3A4高表达肝细胞株比正常肝细胞CYP3A4基因表达提高94倍。Western蛋白质印迹结果显示,CYP3A4高表达肝细胞株CYP3A4蛋白表达水平是正常肝细胞的2.36倍。CYP3A4高表达肝细胞bcl-2mRNA表达水平随三氯乙烯浓度增加呈下降趋势,与正常细胞相比,三氯乙烯0.25和0.5mmol·L-1使CYP3A4高表达肝细胞中的bcl-2mRNA明显升高(P<0.01);三氯乙烯0.5,1.0,2.0和4.0mmol·L-1处理使CYP3A4高表达肝细胞组的凋亡基因胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA表达水平明显升高(P<0.05);三氯乙烯0.5,1.0,2.0和4.0mmol·L-1处理的CYP3A4高表达肝细胞c-fos、c-myc和k-ras基因的表达显著升高(P<0.01),p53表达水平明显下降(P<0.01)。结论三氯乙烯对CYP3A4高表达肝细胞株中的凋亡基因和癌基因表达具有明显促进作用,说明CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素。
- 毛侃琅徐新云何晓阳毛吉炎张然谢杏秦逍云
- 关键词：肝细胞细胞色素P-450CYP3A4慢病毒感染三氯乙烯
- 三氯乙烯对CYP2E1基因高表达细胞和正常肝细胞的毒性作用被引量：4
- 2014年
- 目的 应用分子克隆技术建立CYP2E1基因高表达细胞株,观察三氯乙烯（TCE）对CYP2E1基因高表达细胞和正常肝细胞的毒性,探讨CYP2E1基因在TCE毒性中的作用.方法 用不同剂量三氯乙烯（0、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L）对CYP2E1高表达细胞和正常人肝细胞（L02细胞）进行染毒12h,观察凋亡基因（Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9）和癌基因（c-fos、c-myc、k-ras、p53）表达变化.结果 TCE染毒引起L02肝细胞和CYP2E1高表达细胞Bcl-2表达水平下降,0.25～2.0 mmol/L TCE剂量时L02肝细胞Bcl-2表达下降50％～60％,但相同剂量组的CYP2E1高表达细胞Bcl-2表达水平明显高于正常肝细胞20％～50％; 0.5～4.0 mmol/L TCE剂量时CYP2E1高表达细胞中凋亡基因caspase-3、caspase-8、caspase-9表达水平比正常肝细胞高30％～600％,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）.TCE染毒后对L02肝细胞和CYP2E1高表达细胞的癌基因表达水平有明显差异,在0.5 ～4.0 mmol/L TCE染毒时,CYP2E1高表达细胞的c-fos、k-ras和c-myc基因表达水平明显高于L02肝细胞,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）,升高幅度达25％～120％; CYP2E1高表达细胞的p53表达水平比正常肝细胞表达下降10％～50％,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）.结论 TCE对正常肝细胞和CYP2E1高表达细胞凋亡基因和癌基因表达存在明显差异,提示CYP2E1是TCE在体内代谢的重要因素,与TCE毒性存在一定关系.
- 徐新云毛侃琅袁建辉吴德生黄海燕秦逍云谭琴
- 关键词：三氯乙烯肝细胞细胞色素P-450
- 三氯乙烯药疹样皮炎患者免疫相关基因的表达水平被引量：5
- 2011年
- 目的探讨三氯乙烯（TCE）药疹样皮炎患者外周血免疫相关基因Foxp3、GATA3、CTLA4、T—bet的mRNA表达。方法选取TCE药疹样皮炎患者8例为病例组，8例健康人为对照组，抽取两组对象的外周血，采用实时荧光定量PCR（real—timequantitativePCR）技术检测外周血免疫相关基因Foxp3、GATA3、CTLA4、T—bet的mRNA的表达水平。结果与对照组比较，病例组Foxp3、GATA3、CT—LA4基因mRNA表达水平分别升高115％、97％和241％，差异有统计学意义（P〈0．01）；与对照组比较，病例组T—bet基冈mRNA表达水平下降47％，差异有统计学意义（P〈O．01）。结论TCE药疹样皮炎的部分免疫相关基斟表达水平发生明显改变，这些基因可能在TCE引起的变态反应中发挥重要作用。
- 徐新云刘月峰易娟柯跃斌袁建辉黄海燕毛吉炎毛侃琅
- 关键词：三氯乙烯皮炎超敏反应基因表达
- CYP1A2基因在三氯乙烯毒性中的作用研究
- 目的:应用分子克隆技术,建立CYP1A2基因沉默和CYP1A2基因高表达细胞株,研究CYP1A2基因对三氯乙烯(TCE)毒性的影响。方法:将TCE分别染毒L02肝细胞、CYP1A2基因沉默细胞和CYP1A2基因高表达细胞...
- 毛侃琅徐新云秦逍云谭琴
- 关键词：三氯乙烯凋亡基因癌基因
- 文献传递
- CYP3A4高表达细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响
- 目的:构建CYP3A4基因高表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP3A4高表达细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响。方法:根据GenBank提供的CYP3A4基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表...
- 毛侃琅徐新云毛吉炎
- 关键词：肝细胞CYP3A4慢病毒载体三氯乙烯
- 文献传递
- 特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用
- 本发明提供一种特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP1-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I...
- 徐新云毛侃琅程锦泉彭朝琼
- 文献传递
- CYP2E1基因RNA干扰载体的构建与表达被引量：4
- 2012年
- 目的:构建CYP2E1基因shRNA慢病毒表达载体,为研究CYP2E1在药物代谢和环境污染物代谢中的作用提供技术支持。方法:通过NCBI检索CYP2E1序列,设计合成3对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体PLKO.1-puro,将重组质粒转化到感受态JM107中。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒和包膜蛋白质粒共转染到293FT细胞,收集病毒上清,转导肝细胞L02,利用嘌呤霉素筛选得到CYP2E1缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果结果:PCR和测序结果证明双链shRNA已经正确插入慢病毒载体PLKO.1-puro,共转染293FT细胞得到高滴度病毒,转导L02细胞筛选出CYP2E1基因沉默细胞,荧光定量PCR检测shRNA3的最高抑制效率为86.9%,Western blot鉴定shRNA3基本无CYP2F1表达。结论:利用慢病毒介导RNAi技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。
- 毛吉炎徐新云何晓阳毛侃琅黄海燕刘庆成
- 关键词：CYP2E1RNA干扰慢病毒
