安静
- 作品数：17 被引量：39H指数：4
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- 人乳头瘤病毒18型L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成
- 2014年
- 目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。
- 安静付生芳李雄雄包红寇桂英白幕群余黎
- 关键词：人乳头瘤病毒18型L1蛋白可溶性表达病毒样颗粒
- 人乳头瘤病毒16型L1蛋白的克隆及表达被引量：4
- 2007年
- 采用PCR技术从宫颈癌组织中扩增人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type16,HPV16)L1全长基因片段,目的片段克隆到pMD18T载体后经酶切鉴定及测序确认。构建重组原核表达质粒pGEX4T1-L1,转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导表达出以非可溶性蛋白形式存在的表达蛋白,该重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的17%,免疫印迹检测表明,表达蛋白与宫颈癌病人血清出现特异性反应。成功构建了重组原核表达质粒pGEX4T1-L1,并且在原核细胞中得到表达,为进一步研究L1蛋白的免疫学活性及疫苗的研发奠定了基础。
- 安静余黎席亮白慕群周旭
- 关键词：人乳头瘤病毒免疫
- 一种人乳头瘤病毒疫苗及其制备方法
- 本发明公开一种人乳头瘤病毒疫苗及其制备方法。在本发明中涉及到人乳头瘤病毒的免疫原的建立，对人乳头瘤病毒特定基因的改造，以及人乳头瘤病毒假病毒的制备等方面。
- 胡美浩周旭谢思远余黎钱雪莹安静韩平
- 文献传递
- 人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性被引量：5
- 2015年
- 目的将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原。方法 37℃诱导重组菌体p ET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不同浓度的Triton X-100(细胞裂解液)洗涤包涵体3次。洗涤的包涵体用8 mol/L尿素进行溶解并用镍离子亲和层析方法进行初步纯化,用阳离子交换层析方法对初步纯化蛋白进行最终的纯化。亲和层析纯化蛋白用3种不同的复性液进行了稀释复性。结果 37℃诱导5 000 m L重组菌p ET-42b-F1J/Rossata共收获37 g湿菌体,经过不同浓度Triton X-100洗涤包涵体后纯度可达75%。包涵体用8 mol/L尿素溶解后经镍离子亲和层析纯化纯度约为40%,再用阳离子交换层析介质SP HP进一步纯化样品后纯度可达90%。纯化蛋白以3种不同的复性液都能得到复性,其中复性液3的复性效果相对较好。结论实验中探索了人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的纯化方法及步骤,为后期的蛋白制备及动物免疫奠定了基础。
- 傅生芳朱传凤姜英安静余黎周旭
- 关键词：包涵体复性
- 人3型副流感病毒HN基因的克隆、表达及其免疫原性被引量：3
- 2008年
- 目的克隆人3型副流感病毒(HPIV-3)HN基因,构建原核表达质粒,并检测表达蛋白的免疫原性。方法从呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中提取HPIV-3RNA,用套式RT-PCR扩增HN基因,克隆至pGEM-T载体上,进行核苷酸序列分析,并用生物信息软件分析HN蛋白的二级结构,构建截短的HN基因原核表达载体pET-28a-HN,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测后,进行纯化和复性。并以此蛋白免疫昆明小鼠,检测小鼠血清中HN抗体效价。结果扩增出的HPIV-3的HN基因核苷酸序列与参考序列的同源性为95%,氨基酸序列同源性为97%,有16处发生了突变。截短的HN基因的原核表达载体经酶切鉴定及测序,证明构建正确。重组HN蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,且具有良好的反应原性。复性的重组HN蛋白免疫的小鼠可产生高效价的抗HN抗体。结论原核表达的截短的HN蛋白具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生较高水平的抗体应答。
- 白慕群安静安红包红周旭
- 关键词：HN基因克隆原核表达免疫原性
- HPV16 MuE6/E7嵌合蛋白的原核表达、纯化及其免疫效果被引量：3
- 2008年
- 目的表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性。方法将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果重组MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21 000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%。免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关。免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期。结论已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础。
- 余黎安静韩平周旭
- 关键词：人乳头瘤病毒16型嵌合蛋白原核表达纯化免疫效果
- 精制原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗灭活工艺的改进
- 2000年
- 为了提高精制原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗 (PPHKRV)的质量 ,在甲醛浓度 ,温度和时间相同的条件下 ,对静置法和转瓶法灭活狂犬病毒后制成的疫苗进行了效力测定比较 ,结果表明采用转瓶灭活的PPHKRV效力高于静置灭活法。
- 梁勇王浩魏至栋陈怀恭安静
- 关键词：灭活疫苗效力狂犬病疫苗肾细胞
- 地鼠肾细胞狂犬病纯化疫苗临床研究观察被引量：3
- 2004年
- 了解地鼠肾细胞狂犬病纯化疫苗接种安全性及有效性。分别以 1.0ml及 0 .5ml的剂量 ,按暴露后及暴露前免疫程序给 313人接种 ,用小鼠中和试验法检测血清中和抗体效价。结果显示 :临床副反应轻微 ,副反应率为0 .89%～ 15 % ;免疫全量疫苗和半量疫苗的人群均获保护力 ,抗体阳转率为 10 0 % ,免后抗体GMT滴度分别为35 .2IU/ml(n =32 )和 31.4IU/ml(n =37) ,经检验两组无显著性差异 (P>0 .0 5 ) ;免疫全量疫苗和半量疫苗两组的免疫前、后相比 ,经检验有显著性差异 (P <0 .0 5 ) 。
- 李薇刘增顺王玉琳邹勇刘景华曲小素董关木魏至栋安静马超郑学刚
- 关键词：地鼠肾细胞狂犬病纯化疫苗中和抗体
- 人乳头瘤病毒16型早期基因E6、E7的克隆及表达被引量：1
- 2007年
- 高危人乳头瘤病毒16型的感染与宫颈癌的发病密切相关。HPV16E6和E7蛋白在大多数HPV16相关宫颈癌及其癌前病变中持续表达,因此E6和E7蛋白可作为制备HPV16相关肿瘤及其癌前病变治疗性疫苗的靶抗原〔2〕。采用套式PCR方法,从宫颈癌患者组织中扩增出E6、E7基因并成功构建了包含E6、E7的表达质粒PET-E6、PET-E7。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting分析结果表明,外源基因E6,E7在T7启动子控制下可获得稳定表达。
- 余黎韩平安静姜英周旭
- 关键词：人乳头瘤病毒克隆基因
- 原核表达HPV16 L1蛋白的变性、纯化及复性效果评价被引量：1
- 2009年
- 目的探讨原核表达HPV16L1蛋白的变性、纯化及复性条件,并对复性效果进行评价。方法将重组质粒pET28a-L1转化E.coliBL21(DE3),经放大培养诱导表达后,收集菌体,超声破碎后提取包涵体,并对其进行洗涤、变性,离子交换层析纯化,然后稀释复性。经电镜观察、红细胞凝集试验以及免疫原性分析,对复性效果进行评价。结果L1蛋白在8mol/L尿素中溶解不完全,SDS、硫脲和高pH值可提高其溶解度;纯化后的L1蛋白纯度可达90%;电镜可观察到VLP,并能凝集小鼠红细胞。免疫家兔后,可产生高滴度的抗体。结论复性的HPV16L1蛋白在体外可自我折叠形成具有正确空间构象的VLP,且具有较好的免疫原性,为进一步研制HPV16预防性疫苗及诊断试剂盒奠定了基础。
- 安静白慕群翟雷寇桂英张晋瑾周旭
- 关键词：人乳头瘤病毒16型L1蛋白包涵体纯化复性
