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葛猛: 作品数：64 被引量：122H指数：7; 供职机构：湖南农业大学更多>>; 发文基金：湖南省科技重大专项国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>; 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程医药卫生更多>>

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猪瘟E^rns蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其抗体间接ELISA方法的建立: 2020年; 将人工合成的CSFV E^rns基因插入到pFastBac1获得重组转移载体pFastBac1-E^rns,在DH10Bac大肠杆菌中转座后提取杆粒并转染Sf9细胞,用获得的重组杆状病毒感染High Five细胞表达E^rns蛋白并通过亲和层析进行纯化。以纯化后E^rns蛋白作为诊断抗原,通过摸索抗原包被量和抗体血清稀释倍数等条件,建立检测CSFV E^rns抗体的间接ELISA方法(E^rns-iELISA)。结果显示,E^rns蛋白得到有效表达,相对分子质量约为35000;确定的ELISA抗原包被量为120ng/孔、血清稀释100倍,酶标二抗稀释6000倍,封闭条件为37℃30min,TMB底物作用15min,临界值为0.329。用E^rns-iELISA方法检测92份阴性血清,其特异性为88.04%,与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应;对171份阳性血清的敏感性为92.98%;批内和批间重复的平均变异系数为7.4%和10.74%。结果表明,本试验所建立的E^rns-iELISA方法重复性好,具有较高的检测特异性,且对CSFV疫苗毒和国内流行毒株都具有较高的检测敏感性,具有潜在的开发和应用价值。; 任杰葛猛李润成郑金凌同黎满香李岱霞张磊余兴龙; 关键词：猪瘟病毒杆状病毒表达系统抗体间接ELISA

用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆B细胞的ELISpot试剂盒及其应用: 本发明提供了蛋白组合和用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆B细胞的ELISpot试剂盒及其应用，属于兽医生物技术领域；所述蛋白组合包括Cap‑2b和Cap‑2d。Cap‑2b和Cap‑2d分别为PCV2b和PCV2d的Cap...; 葛猛范方程李润成胡泽奇

副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的原核表达及其表达产物的免疫原性被引量：7: 2010年; 根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌(HPS)D15基因鸟枪序列(登录号:NZ_ABKM01000005)设计1对特异性引物,以HPS5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增了D15基因。将其进行T-A克隆,构建pMD18D15质粒并进行序列测定和分析。结果表明,D15基因含有一个2418bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,与D15基因参考序列的同源性为99.9%。该HPSD15基因的推导氨基酸序列具有典型Omp85蛋白家族的拓扑结构特征。以pMD18D15质粒为模板,用PCR方法扩增HPSD15基因,并将其克隆到pET-28a(+)中,构建pETD15原核表达质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导重组菌,并用SDS-PAGE和Western-blot检测诱导物。结果表明,pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白的分子质量约为94ku,融合蛋白能被HPS阳性血清识别,提示该融合蛋白具有反应原性。昆明小鼠和豚鼠免疫试验结果表明,D15重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。; 朱小宁余兴龙盛益颖李润成罗维葛猛刘俊奇刘春红肖利军将大良; 关键词：副猪嗜血杆菌外膜蛋白原核表达免疫原性

一种改进的高效模拟抗原表位噬菌体的筛选方法被引量：1: 2017年; 以抗红斑丹毒丝菌多克隆抗体为研究对象,首先加入噬菌体与抗体作用,保证目的噬菌体与抗体的高效结合,再通过蛋白A和蛋白G能快速、高亲和力吸附抗体Fc段的特性,将抗体-噬菌体复合物固定在酶标孔中;经洗涤和洗脱后将筛选的噬菌体稀释,分装到10块96孔培养板中扩增。第1轮筛选所获得的噬菌体种类一般少于1×104个,经约1 000倍稀释后,每个酶标孔中扩增的噬菌体少于10个,这将极大地降低噬菌体因竞争扩增而丢失的概率,甚至无噬菌体丢失。结果显示,相比于传统方法从224个样品中获得36个多肽,本次从100个样品中就获得了72个多肽。同时,为满足大量噬菌体样品的验证工作,采用加入40 m L/L吐温-80的培养基在10 m L离心管中以2 m L体积扩增噬菌体,最终的噬菌体效价提高了317%,总量超过8×1010,足以满足后续试验的要求。该改进的方法可以显著提高噬菌体筛选的效率,可操作性强,具有广泛的普遍适用性。; 胡云霏葛猛岑静李润成余兴龙; 关键词：噬菌体展示模拟抗原表位多样性扩增

一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒: 一种检测猪萨佩罗病毒抗体的ELISA试剂盒，其是以纯化的猪萨佩罗病毒VP1重组蛋白作为抗原，首次建立检测PSV抗体的ELISA方法并组装成试剂盒，可对目前我国流行的PSV病毒进行有效的血清学诊断和调查，判断猪群中PSV抗...; 葛猛余兴龙彭旺李润成赵墩郑金丁彦彬; 文献传递

O型口蹄疫病毒VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析被引量：1: 2009年; 以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1。转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组。; 李润成余兴龙白霞向卫军葛猛黎满香; 关键词：口蹄疫病毒 VP1基因 LTB基因抗体效价

猪繁殖与呼吸综合征病毒08HuN株基因组序列测定与分析: 通过分段设计引物，应用RT-PCR方法分6段扩增出非高致病PRRSV08HuN变异株的全基因组，扩增后的产物分别克隆于pMD19-T Simple载体鉴定后测序，应用DNAStar软件按顺序将测序结果拼接得到该毒株全基因...; 肖利军余兴龙肖博仁李润成杨兴东葛猛李杰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组 RT-PCR法; 文献传递

对兽医传染病诊断教学实习课程改革的探讨: 2019年; 兽医传染病诊断实践是一门实践性很强的动物医学类专业实习课程,教学方法对实习效果有较大影响。针对目前教学实习过程中存在教学实习体系不健全,实验室诊断与临床诊断脱节,甚至没有临床诊断的问题,笔者提出了与养殖企业合作建立远程辅助教学实习平台,与兽医第三方检测机构合作开发新的实习基地,以及人为"造病",模拟真实的发病状态的三点解决方案。新的教学实习办法将更加适合现在的养殖新模式和教学新形式,从而使学生能够更加全面地学习和掌握兽医传染病诊断方法。; 葛猛李润成; 关键词：教学方法教学改革

湖南省健康猪群中不同基因型猪博卡病毒流行性及进化分析被引量：3: 2017年; 为了解猪博卡病毒在不同年龄健康猪群中的感染情况,通过对GenBank登录的猪博卡病毒基因序列分析设计2对引物可分别扩增PBoV1/2的部分NS1基因和PBoV3/4/5的部分VP1基因。提取2016年8-12月收集自湖南5个集约化猪场2~20周龄猪共430份肛门拭子样品的DNA并进行PCR检测。PBoV阳性率为64.6%(278/430),PBoV1/2阳性率为27.2%(117/430),PBoV3/4/5阳性率为45.1%(194/430),混合感染率为7.7%(33/430),PBoV3/4/5阳性率显著高于PBoV1/2阳性率(P=0.034)。PBoV1/2在2~10周检出率高于其他周龄,但是与其他周龄猪体内检出率统计分析无显著性差异,PBoV3/4/5主要感染8~16周猪,与4周以内猪差异显著,与其他猪群差异不显著。对各型的核苷酸与参考序列核苷酸相似性分析显示PBoV1/2之间的平均相似度为85.4%,PBoV3/4/5之间的平均相似度为67.2%。PBoV在健康猪群中流行广泛且存在共同感染现象,对猪的健康尤其是肠道微生物平衡可能存在潜在影响。; 屈泰龙李润成罗斌宇葛猛严美君胡辉灿余兴龙; 关键词：流行性进化分析

基于胞内劳森菌重组flgE蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用被引量：5: 2021年; 为建立以胞内劳森菌(LI)重组鞭毛钩基体复合蛋白flgE为包被抗原的间接ELISA检测方法,本研究将flgE基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-flgE,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的flgE重组蛋白。以纯化的重组flgE蛋白为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测LI抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的ELISA方法与CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV、Mhp和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法能检测到1600倍稀释的LI阳性血清,批内和批间变异系数均小于10%。利用该方法检测多个不同类型猪场的猪血清(血清来源:2个种猪场1~5胎次的母猪;3个商品猪场30日龄~140日龄的猪;仔猪30头,从30日龄跟踪至80日龄,共采集4次血清),结果显示,母猪和育肥猪的感染率较高可达100%;母源抗体下降后,自50日龄~70日龄起到育肥猪阶段,LI阳性率和抗体水平随着日龄的增长而不断上升;30头跟踪仔猪在单独密闭的饲养条件下,从开始到全群感染LI所需的时间较短(35 d左右)。这些结果与目前已报道的LI血清流行病学调查研究一致,表明该方法能较准确反映LI感染猪的抗体水平。上述结果表明本研究建立的间接ELISA抗体检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性,可初步用于临床LI血清流行病学的调查。; 廖荣莉郑金熊梦霞罗灵芝赵墩周阳唐红剑葛猛葛猛; 关键词：间接ELISA

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