教育部基金(2002SWXSBJBC22)
- 作品数：3 被引量：8H指数：2
- 相关作者：殷志敏胥俊峰张正平贾晓鹤单建华更多>>
- 相关机构：南京师范大学更多>>
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- 相关领域：生物学轻工技术与工程更多>>
- 重组大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶的PET载体的选择及乳糖诱导作用的初步研究被引量：5
- 2008年
- 采用PCR技术以E.coliK-12基因组DNA为模板扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因,克隆至原核表达载体pET28(a)和pET32(a)中,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),借助SDS-PAGE分析方法,对于用乳糖诱导,由T7lac启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究。在对诱导条件进行优化控制的前提下,分析比较了乳糖诱导pET28(a)/γ-ggt和pET32(a)/γ-ggt两种重组质粒表达大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶蛋白的可溶性及酶活。实验结果表明,对于T7lac启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,低温培养下,乳糖诱导pET32(a)/γ-ggt重组质粒表达γ-谷氨酰转肽酶具有更高的蛋白可溶性和酶活。
- 胥俊峰贾晓鹤张正平殷志敏
- 关键词：Γ-谷氨酰转肽酶克隆乳糖
- 重组人TRAIL胞外片段的原核表达系统选择及蛋白复性研究
- 2006年
- 采用PCR技术从人肝脏cDNA文库扩增出编码114～281位氨基酸的TRAIL基因片段,将之克隆至原核表达载体pET-30a、pQE-30和pJLA503中,上述重组载体经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE鉴定显示pET-30a系统表达效率最高,目的蛋白占菌体总蛋白含量的40%左右;采用透析法或梯度稀释法对TRAIL胞外区片段包涵体进行复性,非还原SDS-PAGE的结果显示梯度稀释法明显好于透析法;纯化后的TRAIL胞外区片段蛋白具有明显的生物学活性,效果与标准品相似;通过添加不同的折叠促进剂对复性效率影响的研究,确立了TRAIL胞外区片段适宜的复性方法,复性效率达75%～80%.
- 吴冬梅金丽娜刘顺谊司马健邰一琳吴一凡乔波殷志敏
- 关键词：TRAIL蛋白表达复性细胞凋亡
- 大肠杆菌γ-ggt原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt的构建及其蛋白表达被引量：3
- 2007年
- 构建大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt及表达与鉴定目的蛋白,为进一步利用该酶催化合成茶氨酸等目的产物奠定了基础。以大肠杆菌DH5α总DNA为模板,用PCR法在γ-ggt编码序列上下游引入酶切位点并扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因;将γ-ggt编码序列克隆入原核表达载体pGEX-4T-1的相应酶切位点;用PCR鉴定重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt,并对插入基因片断测序;重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导后用SDS-PAGE分析表达产物,并经Westernblot鉴定。获得大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因,并成功构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化有pGEX-4T-1/γ-ggt工程菌BL21(DE3)经1 g/L乳糖诱导1 h后即开始表达目的蛋白,在诱导6 h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot鉴定了此目的蛋白。成功构建了大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt,并进行了目的蛋白的鉴定。
- 胥俊峰单建华赵宁伟殷志敏
- 关键词：Γ-谷氨酰转肽酶
