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SELEX技术筛选结核分枝杆菌MPT64蛋白DNA适配子方法学研究被引量：2: 2008年; 目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库，利用sELEX技术筛选，以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选，利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性。结果SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系：PCR扩增的最佳退火温度为65℃；文库优化时，最佳Mg^2＋的浓度为1．5mmol／L；不对称PCR法制备ssDNA时，Mg^2＋的浓度为0．75mmol／L；以酶联板为介质筛选时，在10轮后筛选达到饱和，且随着筛选轮数的增加，PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密，亲和性检测显示第10轮获得的适配子库，比初始的文库亲和性吸光度（A）值增加了9．18倍。将适配子库克隆，随机挑取10个单克隆子，利用混合夹心法检测其与MPT64的亲和性，亲和性范围分布在0．572—1．606之间。结论已初步筛选到与MPT64蛋白高亲和性结合的DNA适配子。; 秦莲花郑瑞娟杨华冯永红王洁胡忠义; 关键词：结核分枝杆菌 SELEX 亲和性

结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定被引量：10: 2008年; 目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子，寻找早期诊断结核病的方法。方法体外合成随机单链DNA（ssDNA）文库，以MPT64蛋白为靶物质，采取SELEX技术进行12轮筛选，将适配子库克隆、测序后，用DNAMAN软件对其结构进行分析，经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力，并利用捕获适配子与检测适配子组成的“三明治”夹心法对获得的适配子进行初步验证。将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0，将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1，采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线，确定最佳阳性判定值，并构建散点图。结果经12轮筛选后，随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析，吸光度值为0．492—1．243，73．3％的适配子的吸光度值在1．0以上；二级结构分析显示，适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构，口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对；“三明治”夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗（BCG）株]和阳性组（结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株）共47个菌株培养上清的检测结果显示，在临界（cut-off）值为0．61时，H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性，BCG株为阴性；阴性组标本的阴性检出率为85．7％，阳性组标本的阳性检出率为87．9％，表现出一定的检测价值。结论已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子。; 秦莲花马占忠郑瑞娟刘忠华陆俊梅胡忠义

结核分枝杆菌CE复合物对人单核-巨噬细胞的功能表型的影响及其作用机制被引量：4: 2008年; 目的研究结核分枝杆菌早期分泌抗原CFP-10-ES-AT-6复合物（CE复合物）对人单核-巨噬细胞功能表型的影响及其作用的细胞信号传导通路。方法分别采用ELISA法以及流式细胞仪检测大肠杆菌克隆表达纯化的CE复合物在不同时间及浓度对人单核-巨噬细胞TNF-α产生对细胞表型的影响，并且应用各种细胞信号传导通路抑制剂来探讨CE复合物作用的细胞信号传导通路。结果结核分枝杆菌CE复合物能够在早期（6～8h）诱导人单核-巨噬细胞活化，大量产生TNF-α，但在晚期（〉48h），则没有此作用；细胞信号传导通路MEK1／2和p38 MAPK的选择性抑制剂SB203580、PD98059、U0126能抑制CE的这种作用；CE复合物在早期（18h）促进单核-巨噬细胞表面抗原提呈功能分子CD80、CD40的表达。结论CE复合物在感染早期可能通过激活MEK1／2和p38MAPK刺激单核巨噬细胞活化，但在晚期则没有此作用。在感染早期可能具有重要的抗结核保护作用。; 杨鑫冯永红刘中华粟波胡忠义邓松华; 关键词：分枝杆菌结核肿瘤坏死因子-Α

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上海市科学技术委员会资助项目(06DZ22034)

文献类型

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