建立A组轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)全基因组单管多重RT⁃PCR扩增方法,并比较其与双链cDNA合成方法在RVA临床标本全基因组二代测序中的应用。对2022年某哨点医院的18份腹泻住院患儿RVA阳性粪便标本进行核酸提取,分别用单管多重RT⁃PCR扩增方法对RVA全基因组进行扩增,用随机引物对病毒核酸进行反转录及双链cDNA合成,最后采用Illumina平台对这2种不同类型的产物进行二代测序。用CLC软件对测序数据进行拼接,分析有效数据量、测序深度及全基因组覆盖度等参数,并用IGV软件查看全基因组测序深度覆盖轨迹。多重RT⁃PCR扩增产物测序和双链cDNA测序获得的RVA有效数据量分别为69.39%~99.83%和0.38%~92.99%,平均测序深度分别为10172×~68156×和35×~61783×,全基因组测序深度10×以上的位点覆盖度分别为98.93%~100.00%和86.28%~100.00%。从全基因组测序深度情况来看,多重RT⁃PCR扩增产物测序在同一个基因节段内部测序深度较为均匀,在11个节段之间测序深度差别较大;而双链cDNA测序在不同基因节段之间的测序深度较为均匀,但同一个基因节段内部靠近5'和3'末端测序深度较低。2种方法所获得的病毒核苷酸序列基本一致,部分基因节段在5'或3'末端100 bp区域内存在2个以内的核苷酸位点差异。在多重RT⁃PCR扩增方法中鉴于引物在不同基因型别间的特异性,对本研究中未涉及到的基因型别的扩增效率还有待进一步验证。单管多重RT⁃PCR扩增方法和双链cDNA合成方法虽然各有优缺点,但均适用于轮状病毒全基因组二代测序在基层的推广。
