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基于FRET的p24抗原表位均相免疫探针构建及其在HIV抗体快速检测中的应用
2024年
目的基于基因编码的Förster共振能量转移(FRET)技术构建HIV p24抗原表位荧光蛋白探针并进行临床验证,为开发快速检测HIV p24抗体的均相免疫检测试剂奠定基础。方法以荧光蛋白ECFP、EYFP作为FRET的供体和受体,将p24抗原表位对应的核酸序列插入ECFP-Linker-EYFP探针骨架,采用定点突变构建p24荧光蛋白二聚化界面,通过pET28a载体构建其重组质粒,进而转化至E.coli BL21感受态细胞中诱导表达p24抗原表位荧光蛋白探针,并采用Ni柱及分子筛对探针进行纯化。筛选探针的最佳浓度,检测探针与p24多克隆抗体的结合能力及光谱学变化。选择60例HIV阳性患者血清和58例正常人血清,通过探针进行检测,通过特异性、敏感度、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率等评价探针对HIV p24抗体的检测效能。结果高通量测序结果显示p24抗原表位荧光蛋白探针构建成功,其理论分子量约为67kDa,最佳浓度为0.20 mg/mL。探针在结合p24多克隆抗体后在530/477 nm处荧光强度比值降低(2.13vs.1.47)。HIV阳性患者血清530/477 nm比值(1.42±0.21)明显小于正常人(1.76±0.11)(P<0.001),两组比值进行ROC曲线分析,得到曲线下面积为0.97,标准误0.02,P<0.001。分析结果表明,p24抗原表位荧光蛋白探针临床检测HIV p24抗体的敏感度为88.33%,特异性为100.00%,阳性预测值88.33%,阴性预测值100.00%,诊断效率为94.07%。结论成功构建基于FRET的p24抗原表位均相免疫检测探针,用于HIV/AIDS患者HIV p24抗体的检测初步显示出了较好的敏感性与特异性,明显缩短了检测时间,为进一步提高HIV p24抗体实验室检测的灵敏度和时效性提供了思路和依据。
王露陈明心郭会军张岱张岱张艳美李强邓博文张艳美刘真桑锋
关键词:艾滋病病毒P24荧光共振能量转移
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